摘要：本文介紹了一種新型的高通量小間距細胞電穿孔裝置，采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，電極間距為80μm。該裝置不僅顯著降低了細胞電穿孔所需的電壓，提高了實驗操作的安全性，還實現(xiàn)了高通量操作，提升了實驗效率。盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但通過進一步優(yōu)化實驗參數(shù)，該裝置在基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

引言

細胞電穿孔技術(shù)，又稱電轉(zhuǎn)染技術(shù)，是一種常用的細胞轉(zhuǎn)染方法。該技術(shù)通過施加一定的電場強度可逆地擊穿細胞膜，在細胞膜上形成小孔或通路，從而將遺傳物質(zhì)引入細胞內(nèi)。自1982年由Neumann等報道以來，電穿孔技術(shù)已成為基因工程領(lǐng)域和新興的合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細胞電穿孔裝置通常需要幾百伏到幾千伏的電壓，操作危險且依賴人工，難以實現(xiàn)自動化運行。

為解決傳統(tǒng)電穿孔儀的局限，微型電穿孔技術(shù)在2000年被提出。微型電穿孔儀雖然提高了細胞存活率和細胞轉(zhuǎn)染率，甚至實現(xiàn)了對單個細胞的電穿孔操作，但處理的細胞數(shù)量偏少，難以滿足生物學(xué)實際應(yīng)用中對細胞數(shù)量的需求。為此，本研究設(shè)計了一種高通量小間距細胞電穿孔裝置，旨在降低細胞電穿孔所需電壓，提高細胞處理量，并實現(xiàn)高通量操作。

材料與方法

1. 裝置設(shè)計與制作

本研究采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作了一種電極間距為80μm的小間距電穿孔裝置。PVC薄膜的厚度決定了電極間距，本實驗采用厚度為0.08mm（80μm）的PVC薄膜。裝置的出入口可以通過硅膠軟管與蠕動泵或注射器相連，實現(xiàn)高通量操作。

2. 實驗材料與試劑

• 菌株：大腸桿菌MG1655（購自某公司）和畢次酵母GS115（購自某公司）。

• 質(zhì)粒：pUC57（購自某公司，質(zhì)粒濃度為122.127ng/μL）和pPIC9K（購自某公司，質(zhì)粒濃度為224.600ng/μL）。

• 試劑：SOC緩沖液、LB（Luria-Bertani）瓊脂培養(yǎng)基、卡那霉素、MD（Minimal Dextrase）培養(yǎng)基、D-山梨醇溶液。

3. 實驗設(shè)備

• 某品牌電穿孔儀：威尼德電穿孔儀，用于提供脈沖電壓。

• 注射泵：用于控制細胞液的注入速度。

• 硅膠軟管：用于連接裝置的出入口與蠕動泵或注射器。

4. 實驗參數(shù)

• 脈沖電壓：通過威尼德電穿孔儀的XXX模式設(shè)定。

• 電穿孔腔體體積：2μL。

• 脈沖發(fā)生器：每5秒施加一次脈沖電壓。

• 注射泵速度：0.4μL/s。

5. 實驗過程

• 大腸桿菌MG1655轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pUC57實驗：

1. 往100μL的感受態(tài)細胞液內(nèi)加入1μL質(zhì)粒，混勻。

2. 通過注射泵以0.4μL/s的速度注入電穿孔裝置進行電穿孔，電壓分別為200V、220V、240V、260V、280V和300V。

3. 電穿孔后，將細胞液與900μL SOC緩沖液混合，放入37℃搖床復(fù)蘇1小時。

4. 將細胞液涂布于含卡那霉素（終濃度為50mg/μL）的LB瓊脂培養(yǎng)基上，放入37℃溫箱過夜培養(yǎng)，第2天早上統(tǒng)計菌落數(shù)。

• 畢次酵母GS115轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPIC9K實驗：

1. 往100μL的感受態(tài)細胞液內(nèi)加入1μL質(zhì)粒，混勻。

2. 通過注射泵以0.4μL/s的速度注入電穿孔裝置進行電穿孔，電壓為150V。

3. 電穿孔后，將細胞液與900μL 1mol/L的D-山梨醇溶液混合，放入30℃搖床復(fù)蘇1小時。

4. 將細胞液涂布于MD培養(yǎng)基平板上，放入30℃溫箱中培養(yǎng)3天，第4天早上統(tǒng)計菌落數(shù)。

實驗結(jié)果

1. 大腸桿菌MG1655轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pUC57實驗結(jié)果

在6種測試電壓下（200V、220V、240V、260V、280V和300V），LB瓊脂板上均有菌落長出，表明這些電壓條件下都有細胞成功電穿孔。然而，相比于采用1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯（通常施加1.8kV脈沖電壓），該電穿孔裝置成功進行電穿孔所需的電壓降低了一個數(shù)量級，但電穿孔轉(zhuǎn)化效率也降低了一個數(shù)量級。

2. 畢次酵母GS115轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pPIC9K實驗結(jié)果

實驗組的MD平板上有菌落長出，但菌落數(shù)量比對照組（采用1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，施加1.5kV脈沖電壓）低了一個數(shù)量級。這表明，相比于1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯，該電穿孔裝置成功進行電穿孔所需的電壓降低了一個數(shù)量級，但電穿孔轉(zhuǎn)化效率同樣降低了一個數(shù)量級。

討論

本研究設(shè)計的高通量小間距細胞電穿孔裝置顯著降低了細胞電穿孔所需的電壓，提高了實驗操作的安全性。同時，通過硅膠軟管與蠕動泵或注射器的連接，實現(xiàn)了高通量操作，提高了實驗效率。然而，電穿孔轉(zhuǎn)化效率比1mm標(biāo)準(zhǔn)電擊杯低了一個數(shù)量級，這可能與以下因素有關(guān)：

1. 電穿孔腔橫截面的長寬比：該裝置電穿孔腔橫截面的長寬比（長度2mm、寬度0.08mm）較大，導(dǎo)致更多細胞處于靠近電極的區(qū)域。而該區(qū)域在施加電壓過程中的溫度、pH變化較大，可能影響電穿孔效率。

2. 電壓波形與持續(xù)時間：針對該電穿孔裝置所采用的電壓波形、持續(xù)時間等參數(shù)可能不夠理想，需要進一步優(yōu)化。

策略與創(chuàng)新

為提高電穿孔效率，可以從以下幾個方面進行優(yōu)化：

1. PVC薄膜通道形狀：通過改變PVC薄膜通道的形狀，調(diào)整電穿孔腔橫截面的長寬比，以減少溫度、pH變化對電穿孔效率的影響。

2. 電壓波形與持續(xù)時間：進一步優(yōu)化電壓波形、大小及持續(xù)時間等參數(shù)，以提高電穿孔效率。

3. 自動化與智能化：隨著科技的發(fā)展，可以設(shè)計智能電穿孔系統(tǒng)，實時監(jiān)測細胞狀態(tài)和電場參數(shù)，自動調(diào)整電穿孔條件，以實現(xiàn)最佳的實驗效果。

應(yīng)用前景

盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但高通量小間距細胞電穿孔裝置在基因工程領(lǐng)域仍具有廣闊的應(yīng)用前景。特別是在需要高通量操作、細胞數(shù)量需求較大的實驗中，該裝置能夠顯著提高實驗效率，降低操作風(fēng)險。此外，通過進一步優(yōu)化實驗參數(shù)，該裝置有望在未來實現(xiàn)更高的電穿孔效率，為基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供更加高效的工具。

結(jié)論

本研究設(shè)計了一種高通量小間距細胞電穿孔裝置，采用電絕緣的聚氯乙烯（PVC）薄膜制作，電極間距為80μm。該裝置顯著降低了細胞電穿孔所需的電壓，提高了實驗操作的安全性，并實現(xiàn)了高通量操作。盡管電穿孔轉(zhuǎn)化效率有所降低，但通過進一步優(yōu)化實驗參數(shù)，該裝置在基因工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。未來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，該裝置有望在細胞治療、基因治療、藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。