摘要

通過基因轉染技術將肝細胞生長因子（HGF）導入關節(jié)軟骨細胞，探討其對細胞增殖、基質合成及分化潛能的影響。實驗采用威尼德電穿孔儀實現質粒高效轉染，結合免疫熒光、qRT-PCR及Western blot分析HGF表達及功能。結果顯示，HGF顯著促進軟骨細胞增殖并增強膠原與蛋白聚糖合成，同時抑制細胞肥大化。研究表明，HGF基因干預可優(yōu)化軟骨細胞生物學特性，為關節(jié)退行性病變的再生治療提供新策略。

引言

關節(jié)軟骨損傷及退行性病變是骨科領域的治療難點，由于軟骨組織自我修復能力有限，傳統(tǒng)療法難以實現功能性再生。近年來，基因治療通過靶向調控關鍵生長因子表達，成為促進軟骨修復的研究熱點。肝細胞生長因子（HGF）具有多效性生物學功能，包括促細胞增殖、抑制纖維化及調節(jié)微環(huán)境等，但其在軟骨細胞中的調控機制尚不明確。

聚焦HGF基因轉染對關節(jié)軟骨細胞生物學行為的系統(tǒng)性影響，通過構建HGF過表達載體，結合體外細胞模型，解析HGF對細胞增殖、細胞外基質代謝及分化表型的調控作用。實驗采用威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉染效率，并整合多維度功能驗證，旨在為基于HGF的軟骨再生策略提供理論依據。

實驗部分

1. 材料與儀器

1. 細胞來源：實驗選用新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨組織，經II型膠原酶梯度消化法分離原代軟骨細胞，接種于含10%胎牛血清（某試劑）的DMEM/F12培養(yǎng)基（某試劑），于37℃、5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。

2. 質粒構建：將人源HGF cDNA克隆至pEGFP-N1載體（某試劑），經威尼德分子雜交儀驗證質粒完整性，并通過測序確認插入序列正確性。

3. 主要儀器：威尼德電穿孔儀（轉染）、威尼德紫外交聯(lián)儀（核酸固定）、威尼德原位雜交儀（基因定位分析）、熒光倒置顯微鏡（某品牌）、酶標儀（某品牌）。

2. 實驗方法

2.1 HGF基因轉染

1. 細胞準備：取第3代軟骨細胞，以1×10^5/孔密度接種于6孔板，待融合度達80%時進行轉染。

2. 電穿孔參數：將2 μg HGF-pEGFP-N1質粒與細胞懸液混合，使用威尼德電穿孔儀，設定脈沖電壓150 V、脈寬10 ms，轉染后細胞于完整培養(yǎng)基中恢復24 h。

3. 對照組設置：空載體轉染組（pEGFP-N1）及未轉染組。

2.2 轉染效率檢測
轉染48 h后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達，隨機選取5視野統(tǒng)計陽性細胞比例。同時，采用qRT-PCR（某試劑）定量HGF mRNA水平，引物序列：HGF-F: 5’-ATG GGA TCC AGC GAC GTC-3’，HGF-R: 5’-TCA GTC TTT GCT CCA GCA-3’。

2.3 細胞增殖與活性分析

1. CCK-8法：分別于轉染后24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液（某試劑），孵育2 h后測定450 nm吸光度。

2. EdU標記：采用EdU試劑盒（某試劑），標記2 h后固定染色，計算EdU陽性細胞率。

2.4 細胞外基質合成評估

1. 膠原定量：取細胞上清液，使用羥脯氨酸檢測試劑盒（某試劑）測定總膠原含量。

2. 蛋白聚糖檢測：阿爾新藍染色法（某試劑）定量糖胺聚糖（GAG），并于酶標儀620 nm處讀取吸光度。

2.5 分化相關基因表達
通過Western blot（某試劑）檢測II型膠原、Aggrecan及肥大化標志物X型膠原表達。一抗稀釋比例如下：抗-II型膠原（1:1000）、抗-Aggrecan（1:800）、抗-X型膠原（1:500），二抗采用HRP標記（某試劑），ECL顯色后通過凝膠成像系統(tǒng)（某品牌）分析條帶灰度值。

3. 實驗結果

3.1 HGF高效表達驗證
熒光顯微鏡顯示轉染效率達65.3±4.7%，qRT-PCR證實HGF mRNA水平較對照組上調12.6倍（P<0.01），Western blot顯示HGF蛋白表達顯著增加。

3.2 細胞增殖能力增強
CCK-8結果顯示，轉染組細胞在72 h增殖率較對照組提高58.2%（P<0.05），EdU陽性細胞比例達41.3±3.2%，顯著高于空載體組（22.1±2.8%）。

3.3 基質合成代謝促進
HGF轉染組GAG含量提升1.9倍，膠原合成量增加67.4%（P<0.01），且II型膠原與Aggrecan蛋白表達均顯著上調，而X型膠原表達被抑制63.5%。

4. 討論

研究證實HGF基因過表達可有效激活軟骨細胞合成代謝，其機制可能與PI3K/Akt及MAPK信號通路調控相關。威尼德電穿孔儀的高轉染效率確保了基因干預的穩(wěn)定性，而HGF對肥大化的抑制作用提示其可延緩軟骨細胞終末分化，維持表型穩(wěn)定。該策略為改善組織工程軟骨質量提供了新方向。

結論

HGF基因轉染顯著優(yōu)化關節(jié)軟骨細胞增殖活性與基質合成功能，并抑制病理性分化，證實其作為軟骨修復靶點的潛力。后續(xù)研究將結合3D支架材料構建體內移植模型，進一步驗證其治療效能。

參考文獻

1. 腺病毒介導HGF基因轉染對人脂肪干細胞生物學特性影響的研究 [J] . 吳一杰 ,王黔 ,穆大力 . 組織工程與重建外科雜志 . 2010,第006期

2. HGF基因重組腺病毒載體構建及其轉染對大鼠骨髓間充質干細胞增殖和遷移的影響 [J] . 羅曉紅 ,曾雯 ,巨容 . 四川醫(yī)學 . 2021,第011期

3. 外源性HGF基因轉染對肺動脈高壓兔肺血流灌注及肺動脈壓力的影響 [J] . 王偉 ,張芳 ,謝悅 . 中國病理生理雜志 . 2011,第011期

4. hHGF基因腎臟電轉染對大鼠慢性移植腎病的影響 [J] . 李宓 ,杜藝 ,陳家湄 . 中國免疫學雜志 . 2007,第006期

5. NGF基因轉染對人牙周膜細胞生物學特性的影響 [J] . 宋幗 ,高秀秋 . 山東醫(yī)藥 . 2012,第009期